虾青素(3,3'-二羟基β, β-胡萝卜素-4,4'-二酮)是一种橙红色的亲脂性酮类胡萝卜素，是一种强效抗氧化剂和营养补充剂,同时也具有良好的治疗潜力。研究表明,虾青素在对抗多种疾病和失调方面表现出显著效果,包括抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎和增强免疫功能,以及预防心血管疾病和动脉粥样硬化等。因此,虾青素在多个行业中展现出良好的应用前景。红法夫酵母因具有生命周期短,合成虾青素速率较快,可以利用各种糖类作为碳源以及可以进行高密度发酵等特征,已成为目前工业化生产虾青素的优质菌株。
为满足工业对天然虾青素日益增长的需求,研究者们正积极开发经济有效的生产工艺以促进红法夫酵母的虾青素合成,包括筛选高产虾青素的菌株、优化培养基和发酵条件、筛选胁迫条件,以及基于虾青素合成途径进行基因改造。由于其成本低、生产稳定且操作简便,胁迫条件已成为促使红法夫酵母积累虾青素的首选方法。研究发现,在培养基中添加500 mg/L二氧化钛可以诱导红法夫酵母细胞产生氧化应激反应,从而显著提升其虾青素产量,达到14.74 mg/L。利用脂肪底物作为碳源培养酵母可将低级脂肪底物生物转化为更高价值的胞内脂类副产品]。KIKUKAWA研究表明,向培养基中添加0.01%的白芒花籽油,可以显著促进红法夫酵母的生长速度,总脂肪酸产量增加2.7倍,虾青素产量增加1.4倍。研究表明,向培养基中添加10 mL/L的大豆油,可以显著提高红法夫酵母的虾青素产量,达到7.35 mg/L ,较对照组增加1.4倍,番茄红素和β-胡萝卜素含量也显著增加。研究表明,微生物可以将有机碳源甘油作为共生生长的底物。ZHANG研究表明甘油通过促进底物丙酮酸的形成和脂肪酸的生物合成,从而间接促进虾青素的合成。若甘油用作发酵底物合成具有附加值的代谢化合物,将为其增值提供可行方案。粗甘油是生物柴油生产中的主要"废物”,在微生物发酵的作用下可转化为用于食品和生物燃料生产的次级代谢物。
本研究探讨了外源甘油与二氧化钛的联合胁迫对PR106的生物量和积累虾青素的影响。采用LC MS/MS技术,对甘油与二氧化钛胁迫条件下PR106细胞内的类胡萝卜素进行了定量分析。此外,通过流式细胞术检测甘油与二氧化钛对PR106的细胞凋亡、活性氧( reactive oxygen species，ROS )生成的影响。并且测定了相关抗氧化酶活性。本研究为红法夫酵母虾青素的工业化生产奠定了理论基础,并具有重要的实践价值。
实验方法
01 菌株培养
取存于-80℃冰箱的PR106菌种用YPD培养基活化,置于恒温培养箱中20℃培养7 d。挑取活化的单菌落接种于装有30 mL YEPD培养基的100 mL三角瓶中发酵,具体的培养方法可以参考学者ZHANG的研究。
02 甘油浓度的筛选
研究了不同浓度甘油(0、5、10、 15、20、25、 30、35、40、 45 mL/L )对PR106的生物量和虾青素产的影响。接菌量为2%(体积分数) , 培养方法如1.3.1节。使用紫外分光光度计测定生物量( OD6oo值)和虾青素( 0D475值)。
03 甘油-二氧化钛联合刺激红法夫酵母PR106
在培养基中分别加入筛选出最佳浓度的甘油和500 mg/L二氧化钛,接菌量为2% (体积分数) , 培养方法如1.3.1节。使用紫外分光光度计测定红法夫酵母的生物量( OD600值)和虾青素( OD47s值)。
04 生长曲线测定
将PR106分别培养至0、8、12、 16、20、24、32、40、48、52、56、60、64、 72、76、80、88 h ,测定其生长曲线。
05 不同时间添加甘油刺激PR106
首先在培养基中先加入500 mg/L二氧化钛,随后将PR106培养至0、16和30 h添加甘油,培养方法如1.3.1节,使用紫外分光光度计测定红法夫酵母的生物量( OD600值)和虾青素( 0D475值)。
06 生物量测定
PR106的生物量采用干重法测定
07 残糖的测定
葡萄糖浓度采用3 , 5-二硝基水杨酸比色法测定。取1 mL培养至72 h的菌液于10 mL容量瓶或具塞刻度试管中,加水至2 m
08 类胡萝卜素测定
采用LC-MS/MS方法检测PR106中类胡萝卜素的含量,提取方法及液相条件参考INBARAJ、RIVERA和RODRIGUES的研究。
09 红法夫酵母细胞凋亡及ROS水平的测定
通过流式细胞术研究了甘油和二氧化钛联合刺激后PR106不同生长阶段的细胞凋亡和ROS水平的变化情况。将PR106细胞进行离心并用PBS洗涤2次,然后将细胞浓度调整为1x 105CFU/mL ,与100 μmoL/L DCFH-DA-起在黑暗中于37℃孵育30 min。随后,样品在低温条件下用PBS洗涤2次,再悬浮于PBS中,用20 μg/mL PI进行染色。在流式细胞仪的FL1通道[ ( 525+20 ) nm]和FL3通道[( 625+20 ) nm]分别采集细胞的绿色荧光( DCFH-DA )和红色荧光(PI)。每个样本检测10 000个细胞,所得数据用FlowJo软件( v10.8.1版)进行分析。
10 酵母细胞抗氧化活性测定
将不同生长阶段的PR106在4000 r/min , 4℃条件下离心10 min以获得酵母细胞,并用蒸馏水洗涤2次。将细胞重悬于PBS中,并在480 W的超声功率下破碎40 min( 5s, 10 s间隔) , 收集上清液,既为粗蛋白溶液。使用南京建成检测试剂盒对SOD活性和CAT活性进行测定。
数据处理与分析
所有试验均重复3次,得出数据用平均值t标准差表示。通过GraphPad Prism 8.0软件进行单因素多元访差分析以及使用IBM SPSS Statistics 24软件进行t-检验分析数据的显著性, P <0.05为差异显著,并进行作图分析。
甘油对PR106生物量和虾青素产量的影响
ZHANG研究发现,外源性甘油可通过增加底物(如丙酮酸)的形成促进虾青素的产生。故测定了不同浓度甘油对PR106的影响。图1-a可知,与对照相比,甘油有效提高了PR106生物量和虾青素产量。随着甘油浓度的增加, PR106的生物量和虾青素产量也呈现出同步增长的趋势。当添加30 mL/L甘油时, PR106的生物量和虾青素产达到最高,分别为14.28和14.83 ,是对照组的1.40倍和1.32倍。然而,当甘油浓度超过30 mL/L后, PR106的生物量和虾青素产:量开始逐渐下降。红法夫酵母是一种专性好氧菌,高浓度的甘油会导致发酵液中溶氧水平的下降,从而抑制酵母的生长。故甘油浓度为30 mL/L是红法夫酵母生产虾青素的最佳条件。
单一的刺激因子虽有效,但其对红法夫酵母虾青素产量的影响有限,某些刺激物对酵母的虾青素生产具有促进或竞争作用,可进一步优化这些刺激物的组合,以实现更佳的发酵效果6]。团队前期研究发现500 mg/L二氧化钛是促进PR106快速积累虾青素的最佳质量浓度 ,因此,将500 mg/L二氧化钛与筛选出的最佳甘油浓度进行组合。图1-b可知,甘油-二氧化钛处理组比对照组显著增加了PR106生物量和虾青素产量。添加500 mg/L二氧化钛和30 mL/L甘油至YEPD培养基, PR106的生物量和虾青素产t量分别为14.51和15.61 ,是对照组的1.52倍和1.51倍。
图1 胁迫条件对PR106生物量和虾青素产量的影响
不同时间添加甘油对PR106生物量和虾青素产量的影响
为了深入探讨双重胁迫对酵母生长周期的影响,并确定甘油添加的最佳时机,故测定了甘油-二氧化钛胁迫下PR106的生长曲线。由图2-a可知,对照组中PR106培养至18h进入对数期,并于54 h进入稳定期。而在甘油和二氧化钛的协同作用下, PR106的生长速度明显加快,仅需16 h便进入对数期,并在64 h后达到稳定期,从而显著延长了其对数期。基于生长曲线的结果,进一步分析了 在不同培养时间添加30 mL/L甘油对PR106发酵效果的影响。由图2-b可知,当0 h添加甘油时, PR106的生物量和虾青素产分别为13.57和14.65 ,分别是16 h添加组的1.07倍和1.07倍, 30 h添加组的1.06倍和1.06倍。根据结果显示,在0 h添加甘油对PR106产虾青素促进效果最佳,这极大的简化了发酵流程,降低了生产环节的复杂性,不仅节省了时间,还有效减少了人为操作造成其它微生物污染的可能性,从而提升了整体的生产效率。
图2 PR106在双重胁迫条件下的生长情况
甘油-二氧化钛对PR106生长和葡萄糖利用的影响
外源胁迫条件在影响微生物生长方面起着至关重要的作用, 是判断胁迫有效性的关键指标。因此,测定了甘油-二氧化钛胁迫PR106不同培养时间的生物量和残糖量。如图3-a所示,添加500 mg/L的二氧化钛和30 mL/L的甘油后,在16 h和30 h时, PR106的生物量与对照组并无显著差异。经过72 h的培养，PR106的生物量显著提升至4.78 g/L ,是对照组的1.16倍,这说明甘油和二氧化钛的添加有效促进了酵母的生长。测定对照组和处理组对葡萄糖的消耗(图3-b )发现,在培养酵母16 h时,甘油-二氧化钛组消耗的葡萄糖更多,但当PR106生长至30 h时,甘油-二氧化钛组的残糖为7.29 g/L,是对照组1.31倍,显著低于对照组。PR106在30~72 h生长过程中,其生物量平均增加速率为1.63 g/L/h ,是对照组的1.16倍(图3-a) , 这是因为甘油可以作为碳源为微生物的生长提供了额外的能量。
图3 PR106在甘油和二氧化钛胁迫下的生物量和葡萄糖消耗
甘油-二氧化钛胁迫对PR106类胡萝卜素产量的影响
类胡萝卜素如-胡萝卜素、番茄红素和玉米黄素等是虾青素生物合成途径中必不可少的中间化合物。八氢番茄红素、番茄红素和β-胡萝卜素都是虾青素合成的前体物质,其中八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶的作用下转化为番茄红素,再通过番茄红素环化酶进一步转化为β-胡萝卜素,随后再进一步 被转化为虾青素。由图4可知,甘油-二氧化钛组中PR106的类胡萝卜素产量为221.03mg/L ,是对照组的1.07倍。值得注意的是,在甘油-二氧化钛胁迫下,虾青素占类胡萝卜素总量的6.98% ,是对照组的3.25倍。与此同时，番茄红素其产量显著下降,其占类胡萝卜素总量的35% ,是对照组的0.64倍;而β-胡萝卜素的产则明显上升，占类胡萝卜素总量的56% ,是对照组的1.74倍。由此可见,在甘油与二氧化钛的共同胁迫下, PR106中番茄红素的显著减少与β-胡萝卜素的增加形成了一个相互促进的过程,共同推动了虾青素的合成。
图4 甘油和二氧化钛双重胁迫对PR106类胡萝卜产量的影响
甘油-二氧化钛双重胁迫对PR106氧化还原稳态的影响
二氧化钛能够刺激细胞产生ROS ,从而诱导细胞死亡。因此,为了进一步研究甘油和二氧化钛对酵母细胞生命力的影响,测定了PR106不同生长阶段的细胞凋亡情况(图5)。当酵母生长至16 h ,对照组和甘油二氧化钛组分别有18%和32%的酵母细胞发生凋亡,这说明外源物质的添加增加了PR106细胞凋亡的程度。细胞凋亡在细胞与其环境的交流中也起着至关重要的作用。因此,甘油-二氧化钛组中凋亡细胞数量的增加是PR106适应外部环境变化并努力维持内部代谢平衡的结果。当酵母细胞生长到30 h ,对照组的细胞凋亡程度依然为18% ,而甘油二氧化钛组的细胞凋亡率降至22% ,这一变化表明酵母细胞对外界环境的适应性逐渐增强。一方面可能是由于虾青素的大量合成,从而改善了PR106对不利生长条件的抵御能力。另-方面也可能是甘油可作为渗透保护剂,可以逆转环境压力的有言影响。
研究表明胁迫条件通常会导致ROS水平上升来促进虾青素的合成。因此,进一步研究了甘油与二氧化钛对PR106中ROS生成的影响。图5可知,在0 h时,对照组和甘油-二氧化钛组的ROS水平没有显著差异,分别为1%和2%。当PR106生长至16 h , PR106表现出强烈的氧化应激反应, 85% (对照组)和84% (甘油-二氧化钛组)的酵母细胞产生了较高水平的ROS。在30 h时,两组之间的ROS水K平分别为33%和34%。经过72 h培养后,对照组和甘油-二氧化钛组的ROS水平恢复到正常范围( 0-1%)。以上结果表明甘油-二氧化钛促进PR106虾青素的生成与ROS水平无关。
图5甘油和二氧化钛联合刺激对PR106细胞凋亡和ROS产生的影响
甘油-二氧化钛双重胁迫对PR106抗氧化酶活性的影响
HASSANPOUR研究表明,虾青素的生成与抗氧酶活性息息相关。细胞的酶系防御体系防御氧化主要通过抗氧化物酶清除自基,如SOD、CAT等,这些机制可以解除因外源刺激导引起的不良反应。为了进一步探究甘油-二氧化钛促进虾青素生成的机制，测定了不同生长时间段的PR106中的CAT和SOD活性。由图6可知,随着发酵的进行,酵母细胞中CAT活性呈上升趋势。在72 h时,甘油-二氧化钛组的CAT活性显著高于对照组。与此同时, SOD活性则呈现为先.上升后下降的趋势。在30 h和72 h时，甘油-二氧化钛组的SOD活性均显著高于对照组。综上所述,添加甘油和二氧化钛显著促进了酵母细胞中CAT和SOD的活性,从而增强了PR106的抗氧化能力。甘油和二氧化钛通过促进SOD活性和CAT活性的增加,从而促进虾青素的产生,提高红法夫酵母细胞的抗逆性,使酵母菌株表现出对外界环境变化较强的适应性。
图6 甘油和二氧化钛胁迫对PR106细胞中抗氧化酶活性的影响
本研究结果表明, 30 mL/L甘油和500 mg/L二氧化钛显著促进了PR106对葡萄糖的有效利用,同时对酵母细胞凋亡未产生显著性影响。更重要的是,甘油和二氧化钛能够延长红法夫酵母PR106的生长对数期,有利于酵母菌株快速适应环境并高效繁殖,显著提升了细胞活力。在甘油和二氧化钛胁迫下, PR106的生物量和虾青素产F 量达到了4.78 g/L和15.42 mg/L ,分别是对照组的1.17倍和3.25倍;类胡萝卜素产量是对照组的1.07倍。令人惊讶的是,在甘油-二氧化钛促进PR106产生虾青素过程中,细胞内的ROS水平无显著变化,但提高了细胞中SOD和CAT的活性,表明甘油和二氧化钛通过酶系防御系统来清除ROS。本研究证实了甘油和二氧化钛的添加有效地促进了红法夫酵母虾青素前体物的合成,从而提高了虾青素产量,这为甘油副产物的有效利用开辟了新的应用前景。本研究为红法夫酵母低成本、高效率地生产虾青素提供了一种可行的方法,具有重要的应用价值。
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