将Chlorellasp.GTD4C-2用培养基(Bold'sBasal Medium,BBM) , 12 h/12 h(光照/黑暗)培养。冷冻干燥(0.2 MPa, -50℃, 4~5h)后得干藻粉。称取干燥小球藻粉1g ,置于4% NaOH (25mL)溶液中,超声破碎10min(400W ,超声脉冲持续时间3.3s ,等待时间3.3s),然后在80℃水浴中加热1h,离心(8000r/min,15min)；收集上清液,加入无水乙醇(1:3)(VN),静置过夜；离心(8000r/min,15min)取沉淀,添加适量3%三氯乙酸，搅拌均匀至沉淀不溶解；离心( 8000 r/min，15 min)收集上清液,用三倍体积无水乙醇沉淀上清两次后,离心( 8000r/min,15min)得沉淀，经冷冻真空( 0.2 MPa,-50℃,4-5 h)即得干燥IPSs；储存在4℃下以供进一步研究。通过对温度、时间、固液比对IPSs提取影响的单因素实验，对IPSs纯化及组成分析，包括IPSs离子纯化、IPSs纯度鉴定、硫酸基含量测定、分子量检测、单糖组成检测、抗氧化活性、羟基自由基检测等方面。

2.1.1温度、时间、固液比对IPSs提取影响的单因素实验

如图1所示，温度、时间和固液比对IPSs提取量( g/g )有影响。在70-80℃时,随着温度升高, IPSs提取量显著增加(P<0.01 ) ; 然而,在进一步升温后,其对提取含量几乎无影响。不同固液比和提取时间数值的增大会导致IPSs含量呈先上升后下降趋势。当时间为1~1.3 h, IPSs提取量达到最大值，之后开始下降。结果表明, IPSs提取量会受到多种因素的影响而产生改变,需要进一步的研究和优化。

图1 单因素实验结果

2.1.2响应曲面优化实验

根据单因素实验结果,按照CCD设计试验,总共进行20组试验,其中14组析因点, 6组中心点,以Design expert 13对数据进行多元回归拟合分析,建立二次回归模型。由此得IPSs多糖提取工艺的二次多项回归方程:Y=0.055 1+0.001 5A+0.004 9B+0.002 6C+0.003 8AB-0.0030AC+0 000 7BC-0.015 7A2-0.0114B-0.0154C2根据表2结果显示, CCD模型的F值为48.77 , P<0.0001 ,由此认定该模型具有极显著性;失拟项为0.135 1 ,差异不显著( P>0.05) ,模型能够充分体现实验情况。

模型相关系数R2=0.977 7 , R2adji=0.957 7，表明实验结果与模型预测结果具有良好的相关性,实验误差小可重复。因此，该模型可用于预测沙漠小球藻IPSs提取量的实验结果。通过模型呈现弯曲趋势可知,模型中C和AB对IPSs提取量具有显著影响, B、A2、B2、c2对IPSs提取量具有极显著影响,证明温度、固液比和时间均对IPSs提取具有复合影响,表明实验的可行性和必要性。各因素对IPSs提取 量的影响大小顺序为:提取温度>固液比>提取时间。

表2 回归模拟方差分析结果

由图2可知,两因素交互效应三维响应面分析结果显示出明显的坡度,同时,通过等高线图可以观察到AB等高线为椭圆形状,说明其相互作用显著。BC更加接近圆形,说明其相互作用较小。基于Design-Expert 13.0分析结果得知,在时间1.03h.温度81.14 °C、固液比1 : 25的条件下, IPSs最优提取工艺可获得0.055 g提取量。为验证响应模型准确性并结合实际情况,最终确定优化条件为时间1h、温度80℃、固液比1 :25 ,在此条件下进行3次实验。实验结果显示IPSs提取量为( 0.054±0.002)g ,超过Dunalella salina多糖提取量0.041g和Arthrospaira platensis 多糖提取量0.042 g ,但低于Wang等对Rhodosorus sp. SCSIO-45730的多糖提取量0.093 g。

图2 两因素交互效应三维响应面及等高线

2.1.3 IPSs分离纯化

利用离子交换层析柱,进行IPSs分离。先使用0.00 mol/L NaCI洗脱(见图3) , 得到多糖IPS- 1提取率为5%。而后依次使用0.50 mo/L和1.00 mol/L NaCI溶液进行洗脱,得到酸性多糖IPS-2、IPS-3 ,提取率分别为6%、12%。实验主要对以NaCI为洗脱液获得的两组多糖,进行后续实验。

图3 IPSs的DEAE Seplife FF梯度洗脱曲线

2.1.4 IPSs纯度鉴定

实验采用紫外吸收光谱对多糖纯度进行鉴定,核酸在紫外光谱下吸收峰为260 nm ,蛋白质在紫外光谱下吸收峰为280nm , IPS-2和IPS-3在260 nm和280 nm无明显吸收峰(见图4),在一定程度上说明三氯乙酸法除蛋白相对彻底,表明样品具有较高纯度。使用紫外光谱检测法检测多糖纯度具有一定的普遍性。

图4 IPS-2、IP S-3紫外吸收光谱图

2.1.5 IPSs组成分析

利用凝胶色谱、激光光散射和示差检测器联用测得样品的绝对分子量。多糖聚合物没有固定分子量,所测分子量为分布平均值。IPSs为多糖粗提物 ,含有一定的蛋白及核酸,其分子量检测数据误差较大，不具有实际意义。通过离子层析柱将IPS-2和IPS-3根据糖骨架进行分离,结果显示IPS-2分子大于IPS-3。通过表3,可知IPSs、IPS-2和IPS-3均含有硫酸基,其IPSs含量最高为( 11.97±0.23) % ,可见离子纯化后的多糖硫酸基含量相对降低。实验结果中IPS-2、IPS-3、IPSs三种样品组成均以葡萄糖和半乳糖为主,与Sun等| 19]和Sang等120]相似,植物多糖大多含有葡萄糖、半乳糖。

表3 IPSs的化学成分(xts,n=3)

2.1.6 红外检测分析

红外检测结果如图5 , -NH、—OH在3 250-500 cm-1伸缩振动, C-H在2 900 cm^-1附近的伸缩振动以及-COOH在1 700^-1 750 cm^-1内振动22均为多糖结构特征吸收峰IPSs , IPS-2 , IPS-3的FT-IR光谱表现出极其相似的特征官能团。1200-1000 cm^-1|范围内C-O-H侧基和C-0-C糖苷振动吸收峰。—NO2在1 500-1 600 cm^-1出峰, C-H弯曲吸收在1433 cm^-1附近，1 433 cm^-1和1 733 cm^-1吸收峰,明显说明IPSs中具有糖醛酸。在790~850 cm^-1处的强吸收带，表明多糖硫酸基团的存在，此外在845 cm^-1和918 cm^-1处出现振动峰, 表明IPSs中存在a-和β-构型。

图5 IPSs. IPS-2、 IP S-3的F T-IR光谱

2.1.7抗氧化活性分析

三份样品均具有明显的DPPH及羟基自由基清除活性, IPSs、IPS-2及IPS-3对自 由基清除活性表现出明显的浓度依赖性。以Vc为阳性对照,发现IPSs对DPPH自由基的IC_5o=0.011 mg/mL ,接近Vc对DPPH自由基的IC₅₀=0.007 mg/mL , IPSs对羟基自由基的ICso=0.737 mg/mL ,同样接近Vc对羟基自由基的IC_5o=0.626 mg/mL ,反而经离子纯化后多糖自由基清除活性减弱。在2 mg/mL时IPSs、IPS-2和IPS-3对DPPH自由基清除率分别为(91.13+2.93) %、( 23.16±0.79) %及(27.36±2.44 ) %(见图6) ,在2 mg/mL时IPS、IPS-2和IPS-3对羟基自由基清除率分别为( 80.01±0.98) %、( 23.19+2.35)%及( 32.06 ±3.78) %。即相同浓度条件下抗氧化活性大小为: IPSs> IPS-3> IPS-2。氧化活性与多糖结构组成、分子量大小等多种因素相关。低分子量对抗氧化强度具有正向影响。单糖(葡萄糖)含量与自由基清除活性呈负相关关系(y=0.785-0.006x, r=-0.905这与本实验结果相互印证。此外,多糖自由基清除活性还与官能团以及硫酸基含量呈相关性。

图6 IP Ss清除DPPH和羟基自由基活性( x±s,n=3)

沙漠小球藻具有极强的抗盐碱和耐旱性,然而对其多糖提取与抗氧化活性检测的研究却相对较少。本文优化沙漠小球藻IPSs提取工艺,并进行分离纯化和活性检测。采用CCD法对IPSs提取工艺进行优化,最终使在温度: 80℃ ;时间: 1 h;固液比( g/mL) 1 :25 ,条件下IPSs提取量最高。通过离子层析法成功分离出两种酸性多糖IPS-2和IPS-3 ,其硫酸基含量分别为(5.69+0.11 ) %、(8.46 +0.03 ) %。同时IPSs、 IPS -2和IPS -3三种样品均主要由葡萄糖和半乳糖组成。

沙漠小球藻IPSs对DPPH自由基表现出ICso=0.011 mg/mL的抑制效果,接近Vc对DPPH自由基的IC5o=0.007 mg/mL ;而在对羟基自由基方面,沙漠小球藻IPSs表现出IC5o=0.737 mg/mL的抑制效果，同样接近Vc对羟基自由基的IC5o=0.626 mg/mL。这种极强的抗氧化活性可能与单糖组成(葡萄糖)含量有关。本文研究结果为沙漠小球藻多糖结构与活性领域提供文献依据并为食品、 药品、化妆品等多个领域潜力产品的开发奠定学术基础。