01 虾青素提取

称取一定量的毕赤酵母干粉于100 mL锥形瓶中,加入-定量配制好的柠檬酸Z醇溶液,超声提取,过滤得滤液。

02 虾青素标准曲线绘制

取10 mg虾青素标准品,乙醇溶解稀释定容至100 mL ,再梯度稀释得到5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25 μg/mL、50μg/mL的标准系列溶液。以Z醇溶液为空白,在474 nm下测定虾青素标准溶液吸光度,实验重复3次。以虾青素质量浓度为横坐标,吸光度A474为纵坐标绘制虾青素标准曲线。虾青素提取计算公式为:

单因素实验

单因素柠檬酸含量确定:称取5份1 g的毕赤酵母干粉,分别加入60 mL 0 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L的柠檬酸Z醇溶液,超声提取40 min ,过滤后取滤液在最大吸收波长474 nm处测定吸光度。

单因素料液比:称取5份1 g毕赤酵母干粉,分别加入30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL的0.2 mol/L柠檬酸乙醇溶剂,超声提取40 min ,过滤后取滤液在最大吸收波长474 nm处测定吸光度。

单因素提取时间:称取5份1 g毕赤酵母干粉,加入60 ml的0.2 mol/L柠檬酸乙醇溶剂,分别超声提取30 min、40 min、50 min、60 min、70 min ,过滤后取滤液在最大吸收波长474 nm处测定吸光度。

正交优化实验

正交优化实验提取参数以柠檬酸浓度(A)、料液比(B)和超声时间(C)等因素作为考察对象,以虾青素提取率(Y)为响应值,采用SPSS Statistics 21统计分析软件的正交分析法安排实验,以获取最适工艺参数。Lg(3')正交实验各因素及其水平 

体外抗氧化活性测试

虾青素提取液经过40 °C真空旋转蒸法浓缩,保存在-18 °C用于抗氧化活性的测定。清除DPPH自由基能力测定:实验采用酶标仪法测定虾青素清除DPPH自由基的能力。分别移取100 μL 100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL的虾青素溶液于96孔板中,加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,匀,室温下避光反应30 min后,在波长为517 nm下测定吸光度并记录吸光度A2。移取100 μL无水乙醇于96孔板中代替虾青素溶液,测定吸光度值为A1。以100 μL无水乙醇代替DPPH溶液,测定吸光度Ao。对照品Vc操作同上, 实验设计3组平行,清除率按照下式进行计算:

清除ABTS自由基能力测定:实验采用酶标仪法测定虾青素清除ABTS自由基的能力,将配制好的7 mmol/L的ABTS和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液避光反应12- 18 h ,加入适量PBS缓冲液使其吸光度在0.7-0.8得ABTS工作液。分别移取10μL 100 μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25 μg/mL的虾青素溶液于90孔板中,加入190 μ的ABTS溶液,混匀,室温孵育6 min ,在波长734 nm下测定吸光度A2。移取10 μL无水乙醇于96孔板中代替虾青素溶液,测定吸光度A1。以100 μ无水乙醇代替DPPH溶液,测定吸光度A0。对照品Vc操作同上,实验设计3组平行,清除率计算公式为:

数据分析

单因素实验数据采用Microsoft Excel 2019、SPSS 21.0统计软件进行统计分析并绘图。

标准曲线绘制

在吸收波长474 nm处测定虾青素各梯度标准溶液吸光值(图1) ,得标准曲线方程为Y=0.0093X+0.049 6(R2=0.999 6),式中, X为虾青素质量浓度, μg/mL ; Y为波长474 nm下的吸光值。邮1可知,线性相关系数显著,表明在0 ~ 50 μg/mL质量浓度范围内具

有线性关系。

图1 虾青素标准曲线

单因素考察

图2可知,在柠檬酸含量为0 ~0.2 mol/L时,毕赤酵母中虾青素提取率随柠檬酸浓度增加而提高,在0.2 mol/L时提取效率最高，太高浓度柠檬酸会损失部分虾青素。

图2 柠檬酸浓度对虾青素提取量影响

图3可知,虾青素提取率随着料液比增加而提高,当料液比达到1 : 60时,虾青素提取率最高。

图3 料液比对虾青素提取量影响

由图4可知,随着超声时间的增加,毕赤酵母中提取的虾青素也随之增加。在超声时长为60 min时虾青素提取率最大。

图4 提取时间对虾青素提取量影响

正交实验

正交实验结果表2、表3可知,各因素影响虾青素提取率的主次顺序为C> A>B ,即提取时间对虾青素得率和含量影响最为显著,其次为柠檬酸含量,最后为料液比。实验结果表明,提取时间和柠檬酸浓度对虾青素得率和含量影响极显著,料液比对虾青素得率的影响不显著。以虾青素得率调整出最佳组合为A2B2C3 ,最佳提取工艺: 0.2 mol/L柠檬酸乙醇溶液,料液比1 : 60 ,超声提取60 min后过滤，测定虾青素含量。

抗氧化活性测试

清除DPPH自由基

以Vc为对照,对不同含量虾青素和Vc清除DPPH自由基能力进行了比较,结果见图5、图6。由图可知,随着Vc和虾青素浓度升高,其对DPPH自由基清除能力逐渐增强。Vc的IC5o为7.03 μg/mL ,虾青素[Cso为17.88 μg/mL。Vc对DPPH清除率略优于毕赤酵母中所提取虾青素。

图5不同浓度虾青素对DPPH自由基清除效果

图6不同浓度Vc对DPPH自由基清除效果

清除ABTS自由基

略7可知,虾青素对ABTS具有很好的清除效果,其清除能力与添加浓度遵循剂量效应关系。Vc的IC5o为75.22 μg/mL ,毕赤酵母中虾青素的ABTS的IC5o为10.32 μg/mL。毕赤酵母中虾青素对ABTS清除能力显著优于Vc。

图7 不同浓度虾青素对ABTS自由基清除效果

图8 不同浓度Vx对ABTS自由基清除效果

以乙醇为提取溶剂,用超声辅助方法提取毕赤酵母干粉中虾青素,单因素实验和正交实验设计优化了提取参数,得到最优提取条件为0.2 mol/L的柠檬酸、料液比为1 : 60、超声时间60 min ,此时虾青素得率为586.74 μg/g。各因素对虾青素提取含量的影响大小依次为超声时间>柠檬酸浓度>料液比。本方法制备虾青素提取液具有良好的抗氧化活性,对DPPH和ABTS的半抑制浓度分别为17.88 μg/mL和10.32 μg/mL ,且该法提出的虾青素可溶于水,增加了虾青素在化妆品中的用途。